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1型神经纤维瘤病患者淋巴细胞中等位基因复制的修饰

编辑:INC|发布时间:2020-12-18 15:57|点击次数:
基因的转录活性与其复制时机有关,因此基因激活与从晚期复制到早期复制的转变相关,反之亦然...

  哺乳动物基因组DNA复制的时间顺序是一个高度程序化的过程,与遗传物质的各种功能有关。许多研究已经证明了基因复制时间与其表达之间的密切联系。因此,在细胞周期的DNA合成阶段(S阶段),表达位点复制较早,而未转录的位点复制较晚。在染色体水平上,这种现象最好的例子是真兽类雌性体细胞中的X染色体复制模式,活跃的X染色体复制比其不活跃的X染色体复制得早得多。在基因水平上,表达与复制时间的相关性表现为单等位基因的异步复制模式,即活性等位基因比非活性等位基因更早复制。这种关系在各种单等位基因表达的基因中都有记载,如X染色体失活基因、印迹基因和等位基因排斥基因。相反,同时表达的等位基因,双等位基因表达,复制高度同步。

  荧光原位杂交(FISH)是用于估计复制过程中对偶基因之间的时间协调性和任意给定DNA序列的复制时机的选择方法。在FISH复制试验的基础上,一个非复制位点假设一个点状杂交信号(单点标记S),而一个复制位点以二部标记信号(双点标记D)出现。因此,同步复制的等位基因(假设同时表达)在细胞周期的复制阶段显示出两种不同信号的细胞(SD细胞)的低频率,而异步复制的等位基因显示出更高频率的SD细胞。因此,用DNA特异性探针跟踪FISH,利用SD细胞的频率来阐明已识别的DNA序列的复制模式。基因的复制时机与其转录状态之间的紧密联系使得FISH复制试验可以作为检测发育过程中各种基因表达模式的可靠工具,以及监测突变等位基因的转录能力。使用鱼复制试验结果表明:biallelically表达基因,通常在等位基因显示同步复制,当出现在各种类型的血液恶性肿瘤患者血细胞改变他们固有biallelic异步复制和复制方式高度,同样monoallelically表达基因。这种复制模式的癌相关性改变被观察到与癌相关的基因,如肿瘤抑制基因RB1和TP53,原癌基因CMYC和HER2,分化基因AML1。在宫颈癌的癌前和恶性细胞中,以及实性肿瘤患者的非恶性细胞(淋巴细胞)中,也观察到AML1和TP53固有的双等位基因复制模式向等位基因特异性模式的转变。此外,最近有人提出,在正常同步复制的基因中显示的等位基因特异性复制可能作为一种易患恶性肿瘤的生物标志物。在本研究中,我们分析了三种癌症相关基因RB1、AML1和CMYC在1型神经纤维瘤病(NF1)患者细胞中的复制模式。NF1是一种常染色体显性遗传病,估计发病率为2500 / 3300活产婴儿中的1例,被认为是男性最常见的单基因疾病之一。与正常人群相比,NF1患者患各种类型癌症的风险增加。NF1基因位于17q11.2染色体区域,是一个横跨300 kb基因组DNA的大基因。mRNA的大小为11 13 kb,在所有检查过的组织中均可检测到。NF1基因座(神经纤维蛋白)的蛋白产物在结构和功能上与下调细胞原癌基因(p21-RAS)的GTPases激活蛋白家族相似。据报道,NF1患者肿瘤中由于神经纤维蛋白活性丧失导致p21-RAS激活增加。此外,NF1基因的体细胞突变被描述为各种类型的恶性肿瘤,与NF1疾病无关。尽管在确定NF1疾病的分子基础方面取得了进展,但诊断仍主要基于临床标准,尽管症状前检测NF1疾病对于适当的咨询、早期发现恶性肿瘤和监测与疾病相关的并发症具有重要意义。本研究的目的是确定,首先,NF1疾病是否伴随着与癌症相关基因复制的等位基因模式的改变,其次,检查等位基因特异性复制在鉴定异常NF1等位基因携带者方面的潜在作用。

  我们的研究结果表明,bi等位基因表达的基因,如RB1、AML1和CMYC,当在NF1患者的phar刺激淋巴细胞中出现时,在等位基因复制时间上表现出失同步。因此,NF1患者淋巴细胞内等位基因复制固有时间顺序的丧失是一种非位点特异性的现象,最有可能影响多种位点、抑癌基因和原癌基因。此外,研究表明,NF1表型患者来源的外周血淋巴细胞在等位基因复制时间方面表现出同步性缺失,这与血液恶性肿瘤患者来源的淋巴细胞和肾细胞癌相似。这表明,等位基因复制的同步性丧失既不是疾病特异性的,也不是癌症的结果,但可能是原因,据我们所知,我们检查的NF1患者没有临床恶性肿瘤。因此,我们的研究结果支持这样一种观点,即等位基因复制的失同步是恶性倾向的一个标记。

  在本研究中,我们利用FISH复制试验应用于未患癌症个体的外周血淋巴细胞,发现RB1、AML1和CMYC在等位基因复制时间上具有高水平的同步性,正如常见孟德尔模式表达的基因所预期的那样。RB1位于13q14上,是人类肿瘤中第一个被证明功能缺失的基因,是典型的肿瘤抑制基因。AML1基因定位于21q22,是人类血液恶性肿瘤中最常见的易位基因之一,常与白血病表型有关。CMYC是公认的位于8q24的原癌基因。在10例健康受试者中,RB1、AML1和CMYC在复制时间上表现出同步性。组内各位点复制时机的变异程度相当低。这表明研究结果是可重复的,FISH复制实验可以作为检测基因复制时间顺序的可靠工具,与以往检测双等位基因表达基因的结果一致。相比之下,三个独立的基因,RB1 AML1, CMYC,驻留在不同基因位点(13 q14, 21岁的时候,和8抓起,分别),和有不同的生物功能,当出现在NF1患者淋巴细胞,都显示相同的复制修改,每个给上升到一个早期和晚期等位基因复制。NF1患者淋巴细胞中这三个基因的两个对位等位基因的时间差异与通常观察到的一个印记位点的两个等位基因的时间差异几乎相似,这是显示等位基因之间功能差异的基因座原型。患者细胞中所有三个位点的等位基因特异性复制都是通过单个等位基因的高级复制实现的,其复制时间明显早于正常计划的时间,SS细胞频率的大幅下降证明了这一点。

  此外,第二个等位基因受到NF1条件的轻微影响,而且DD细胞的频率轻微增加,证明它的复制也比该基因的正常时间稍早。因此,从复制时间和基因活性之间的相关性推断,可以假设NF1紊乱,破坏等位基因之间的协调,激活基因。人们可以进一步推测,神经纤维蛋白活性的降低,NF1疾病的典型分子缺陷,与细胞周期调节基因的激活有关。这与神经纤维蛋白作为gtpaseactivation protein的生化作用是一致的。如果这一推测被证明是正确的,那么在患者细胞中,具有相反功能的基因可能会相互补偿,这里的例子是建议的原癌基因过表达与可能的抑癌基因的激活。因此,这可能解释了为什么不是所有的NF1患者都发展成恶性肿瘤,以及为什么这种情况的表型表达存在巨大差异。由于等位基因复制时间的失同步在NF1患者和对照受试者之间有很好的区别,这种标记物可能有一个潜在的用途,用于识别NF1疾病的症状前携带者。这一点尤其重要,因为目前的突变筛选技术由于基因及其转录产物的大尺寸和突变的异质性而需要大量劳动。同步性生物标志物丧失的临床应用需要进一步的研究评估。

  参考文献:Doi:10.1016 / s0165-4608(02)00858-0

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