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纳曲本激活TRPM7促进胶质母细胞瘤细胞的迁移和侵袭

编辑:INC|发布时间:2020-09-29 15:05|点击次数:
胶质母细胞瘤能活多久?关于胶质母细胞瘤的前沿研究...

  胶质母细胞瘤(glibioblastoma,GBM)是中枢神经系统中十分常见、极具侵袭性的脑肿瘤,目前仍是一种致命的疾病,中位生存期<15个月。胶质母细胞瘤(GBM)是一种致命的进行性脑肿瘤,5年生存率<10%。GBM通过降解细胞外基质无限制地增殖和侵入整个脑组织,导致其相当大的治疗抵抗力。GBM患者的治疗选择极其有限,且结果不理想。

  胶质母细胞瘤标准的治疗方法是手术切除肿瘤,然后是替莫唑胺化疗和放疗。然而,由于缺乏特异性,目前使用的佐剂具有很强的细胞毒性。需要进一步的研究来阐明GBM功能的基本机制,以便找到既能杀死肿瘤又能保留健康细胞的替代品。本质上,如果我们希望开发出对GBM高度特异且毒性更小的治疗方法,我们需要更好地了解GBM潜在治疗靶点的参与。

  INC世界神经外科顾问团成员、世界神经外科学院前主席、加拿大多伦多大学儿童医院SickKids脑瘤研究中心主席James T. Rutka教授在其《Activation of TRPM7 by naltriben enhances migration and invasion of glioblastoma cells》论文中记录了他们对于胶质母细胞瘤的研究。该研究利用GBM细胞系U87,评估了TRPM7激活剂纳曲宾对GBM活性、迁移和侵袭性的影响。

胶质母细胞瘤

  首先,利用全细胞膜片钳技术,我们发现纳曲本增强了U87细胞内源性TRPM7样电流。此外,通过Fura-2ca2+显像,我们观察到纳曲本应用后钙离子内流情况。纳曲本显著增强了U87细胞的迁移和侵袭能力(通过划痕实验、基质凝胶侵袭实验和MMP-2蛋白进行了评估),但没有提高细胞的存活率和增殖能力(用MTT法评估)。用免疫印迹法检测p-Akt/t-Akt和p-ERK1 | 2/t-ERK1 | 2的蛋白水平。我们发现纳曲本可增强MAPK/ERK信号通路,但不能增强PI3k/Akt通路。因此,增强的TRPM7活性有助于GBM的破坏性迁移和侵袭特性。

  TRPM7是一种非特异性的二价阳离子通道,在几乎所有的组织中都有表达,属于瞬时受体电位(TRP)离子通道超家族中的美拉司他丁亚家族。离子通道是药物开发的重要靶点。TRPM7被认为是GBM的潜在治疗靶点,除其他癌症外,包括:胰腺癌、白血病、头颈癌、前列腺癌、视网膜母细胞瘤、鼻咽癌、胃癌、卵巢癌和乳腺癌。以前的研究已经表明TRPM7参与GBM是由于通道的异常活动和通过使用技术降低TRPM7功能(即敲除或药物抑制)在癌组织中的上调。然而,目前文献中还没有研究TRPM7通道活性的增强是否会增强GBM的功能(即增殖、迁移和侵袭)。

  直到最近,还没有可靠的药理化合物可以作为特异性TRPM7激动剂。使用基于Ca2+成像的分析方法筛选出一组具有不同结构主干的20个小分子,这些小分子可以诱导TRPM7电流。与其它化合物相比,δ阿片类拮抗剂纳曲宾是选择性最强的TRPM7正门控调节剂。纳曲本对TRPM7的EC50计算为~20μM;在50μM时,纳曲本对其他TRP通道没有影响,包括TRPM2、TRPM8和TRPV1[14]。此外,作者发现纳曲本在低PIP2条件下也能可逆地激活TRPM7通道,并且没有细胞内Mg2+耗竭。通过一系列的诱变实验,作者还发现纳曲宾激活TRPM7的位点位于TRP结构域。最初被用作δ阿片受体拮抗剂,但需要注意的是,尽管纳曲本与其他阿片受体拮抗剂(如纳曲酮)具有很高的结构相似性,但其他任何一种都不能刺激TRPM7通道。

  目前的研究通过一种新的方法来评估TRPM7对GBM功能的影响。也就是说,我们评估了用纳曲本增强TRPM7活性是否能提高U87细胞的存活率、迁移率和侵袭力。此外,Rutka研究团队还通过研究相关的信号通路来探讨潜在的机制,采用MTT法、划痕法、基质胶侵入法、免疫印迹法、Ca2+显像法和膜片钳电生理学方法检测纳曲宾对U87细胞功能结果的影响。

胶质瘤

  最终,该论文得出结果:纳曲本可增强U87细胞内源性TRPM7样电流。以前报道过,与正常人星形胶质细胞相比,U87细胞中TRPM7通道的mRNA和蛋白质表达及其活性上调。先前已在原发性心室肌细胞以及过度表达TRPM7的HEK293细胞中证实了纳曲宾激活TRPM7电流。在本研究中,我们首先通过全细胞膜片钳记录证实了纳曲宾对U87细胞内源性TRPM7样电流的增强作用。图1A和1B显示纳曲本(50μM)灌注可激活稳健的TRPM7样电流。与TRPM7的形状和特性相一致,纳曲本激活电流较大且向外整流。纳曲宾的激活是可逆的,因为TRPM7样电流随着纳曲本的洗出而减少。如图1C所示,100mV时的初始外向电流密度为9.7±2.4Pa/pF,纳曲宾显著增强TRPM7样电流至31.3±4.9Pa/pF(p<0.001;n=6)。在我们之前的研究[4]中,我们报道了300μM香芹酚抑制基础U87 TRPM7样电流。在这里,为了进一步证实纳曲宾的作用是由TRPM7介导的,我们用香芹酚检测了它是否也能抑制纳曲宾增强的U87细胞TRPM7样电流。图1D-1F说明,香芹酚抑制了纳曲宾增强的类TRPM7电流,使TRPM7样电流降低到6.8±1.7pa/pF。研究结果表明,U87细胞内内源性TRPM7样电流对纳曲本增强敏感。

  Rutka教授在该论文的最后结论为,MMP-BEN-7蛋白增强,可能通过上调pMTRIK/MAPER7。这一发现提供了进一步的证据表明TRPM7是GBM的一个治疗靶点。

  原文链接:https://www.oncotarget.com/article/14496/text/

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