【INC国际大咖研究成果】整合（表观）基因组分析确定中枢神经系统横纹肌样瘤亚群特异性治疗靶点-INC国际神经外科医生集团

　　INC国际儿童脑瘤大咖、世界神经外科联合会(WFNS)执行委员会&顾问委员会成员之一的James T. Rutka教授发表研究《Integrated (epi)-Genomic Analyses Identify Subgroup-Specific Therapeutic Targets in CNS Rhabdoid Tumors》(整合(表观)基因组分析确定中枢神经系统横纹肌样瘤亚群特异性治疗靶点)，以下是研究简述。

James T. Rutka教授

　　01. 摘要

　　我们最近报告非典型畸胎瘤样横纹肌样瘤(ATRT)至少包含两种具有不同临床结局的转录亚型;然而其治疗异质性的潜在机制尚不明确。在本研究中，我们分析了 191 例原发性 ATRTs 和 10 个 ATRT 细胞系，以确定 ATRTs 的基因组和表观基因组特征，并识别亚群特异性治疗靶点。我们发现 ATRTs 分为三个表观遗传亚群，这些亚群具有独特的基因组特征、SMARCB1 基因型和染色质景观，且与细胞对一系列信号和表观遗传抑制剂的差异反应相关。值得注意的是，我们发现PDGFRB相关增强子的差异甲基化使第2组ATRT细胞对达沙替尼和尼洛替尼具有特定敏感性，并提示这些药物是治疗这种高度致命的ATRT亚型的有前景的疗法。

　　02. 简要概述

　　Torchia 等人研究表明，非典型畸胎瘤样横纹肌样瘤(ATRTs)由三个表观遗传亚群组成，这些亚群与细胞对一系列信号和表观遗传抑制剂的差异反应相关。特别是，达沙替尼和尼洛替尼被确定为针对2组ATRT的潜在治疗药物。

　　03. 研究意义

　　ATRTs 曾被认为是遗传上均质、基因组特征单一的肿瘤。我们的整合基因组研究显示，ATRT 具有更高的非编码区突变率和以编码区结构变异为主的特征，这表明其基因组构成更为复杂。我们鉴定出三个与独特基因型、染色质特征及功能景观相关的 ATRT 表观遗传亚组，这些亚组与细胞对多种信号传导和表观遗传通路抑制剂的差异反应相关。值得注意的是，我们发现两种已被充分研究的抗癌药物 —— 达沙替尼和尼洛替尼，对第 2 组 ATRTs 具有潜在治疗效果。结合我们此前的研究结果，本数据为开发基于风险和生物学特征分层的 ATRTs 临床试验提供了有力依据。

　　04. 研究亮点

ATRTs 可分为三个分子和表观遗传亚组：第 1 组、2A 组和 2B 组
不同的染色质景观驱动亚组特异性谱系和信号特征
ATRT 亚组对信号传导和表观遗传抑制剂表现出不同敏感性
表观遗传调控的 PDGFRB 增强子驱动第 2 组 ATRTs 对酪氨酸激酶抑制剂(TKI)的敏感性

INC国际儿童脑瘤大咖、世界神经外科联合会(WFNS)执行委员会&顾问委员会成员之一的James T. Rutka教授发表研究《Integrated (epi)-Genomic Analyses Identify Subgroup-Specific Therapeutic Targets in CNS Rhabdoid Tumors》（整合（表观）基因组分析确定中枢神经系统横纹肌样瘤亚群特异性治疗靶点），以下是研究简述。 01PART摘要我们最近报告非典型畸胎瘤样横纹肌样瘤（ATRT）至少包含两种具有不同临床结局的转录亚型；然而其治疗异质性的潜在机制尚不明确。在本研究中，我们分析了 191 例原发性 ATRTs 和 10 个 ATRT 细胞系，以确定 ATRTs 的基因组和表观基因组特征，并识别亚群特异性治疗靶点。我们发现 ATRTs 分为三个表观遗传亚群，这些亚群具有独特的基因组特征、SMARCB1 基因型和染色质景观，且与细胞对一系列信号和表观遗传抑制剂的差异反应相关。值得注意的是，我们发现PDGFRB相关增强子的差异甲基化使第2组ATRT细胞对达沙替尼和尼洛替尼具有特定敏感性，并提示这些药物是治疗这种高度致命的ATRT亚型的有前景的疗法。 02PART简要概述Torchia 等人研究表明，非典型畸胎瘤样横纹肌样瘤（ATRTs）由三个表观遗传亚群组成，这些亚群与细胞对一系列信号和表观遗传抑制剂的差异反应相关。特别是，达沙替尼和尼洛替尼被确定为针对2组ATRT的潜在治疗药物。 03PART研究意义ATRTs 曾被认为是遗传上均质、基因组特征单一的肿瘤。我们的整合基因组研究显示，ATRT 具有更高的非编码区突变率和以编码区结构变异为主的特征，这表明其基因组构成更为复杂。我们鉴定出三个与独特基因型、染色质特征及功能景观相关的 ATRT 表观遗传亚组，这些亚组与细胞对多种信号传导和表观遗传通路抑制剂的差异反应相关。值得注意的是，我们发现两种已被充分研究的抗癌药物 —— 达沙替尼和尼洛替尼，对第 2 组 ATRTs 具有潜在治疗效果。结合我们此前的研究结果，本数据为开发基于风险和生物学特征分层的 ATRTs 临床试验提供了有力依据。 04PART研究亮点・ATRTs 可分为三个分子和表观遗传亚组：第 1 组、2A 组和 2B 组・不同的染色质景观驱动亚组特异性谱系和信号特征・ATRT 亚组对信号传导和表观遗传抑制剂表现出不同敏感性・表观遗传调控的 PDGFRB 增强子驱动第 2 组 ATRTs 对酪氨酸激酶抑制剂（TKI）的敏感性 05PART肿瘤和患者信息所有肿瘤和临床信息均通过国际协作网络收集，并按照参与机构医院研究伦理委员会批准的协议获得知情同意。共收集了194例中枢神经系统（CNS）样本（191例原发性和3例复发性）和9例非中枢神经系统（non-CNS）横纹肌瘤（RT）样本用于基因组分析（表S3）。所有非典型畸胎瘤样横纹肌瘤（ATRT）均根据世界卫生组织（WHO）中枢神经系统肿瘤分类标准（Louis和Wiestler，2007）诊断，并通过BAF47免疫染色（BD Biosciences，目录号612110）确认。通过荧光原位杂交（FISH）、多重连接探针扩增（MLPA）、针对外显子1-9的Sanger测序或全基因组/外显子组测序（WGS/WES）分析，确认了SMARCB1基因的双等位基因改变。对冰冻肿瘤样本的DNA或RNA进行了全基因组/外显子组测序（WGS/WES）、RNA测序（RNA-seq）以及高分辨率拷贝数/SNP、基因表达和甲基化阵列分析中的一种或多种；对123例来源于甲醛固定、石蜡包埋材料的DNA样本进行了Illumina 450k甲基化阵列分析。动物实验按照多伦多表型基因组学中心批准的动物伦理待遇政策和规定进行。图 1：ATRT 编码基因组主要受结构改变影响。（A）ATRT 中全基因组和编码区体细胞突变率。使用 26 例原发性 ATRT 的 WGS 和 WES 数据（匹配正常 DNA）计算每兆碱基体细胞突变率中位数。箱线图中间为中位数，箱体边界代表第一和第三四分位数；须代表最小值和最大值。（B）180 例原发性 ATRT 的复发性结构改变的 Circos 图，包括通过整合 WGS、RNA 测序、SNP 和 450k 甲基化阵列拷贝数数据检测到的 SCNAs 和基因重排。（C）相对于 SMARCB1 蛋白 DNA 结合域（DBD）和重复区域 1 和 2（Rp1 和 Rp2）的 SMARCB1 改变示意图。（D）通过 RNA 测序在 ATRT T51 中发现的 SMARCB1 第 5 外显子（灰色）和 HORMAD2 第 11 外显子（橙色）的 chr22q 染色体内融合示意图，显示融合 mRNA 的共识序列，以及通过 RT-PCR 和 Sanger 测序验证融合 mRNA。（E）通过 WES 在 ATRT T12 中发现的涉及 SMARCB1 第 5 内含子（灰色）和 GTPBP1 第 1 内含子（蓝色）的 chr22q 染色体内易位示意图，显示相应基因片段的 CREST 预测 mRNA 共识序列，以及通过 PCR 和 Sanger 测序验证断裂点。图 2：ATRT 包含三个具有不同临床特征和基因型的表观遗传亚群。（A 和 B）通过无监督的共识层次聚类（HCL）和非负矩阵分解（NMF）聚类分析，基于 450k 甲基化阵列（A）或 Illumina HT12 基因表达阵列数据（B）对 ATRT 进行分类。调整后的 Rand 指数表示甲基化和基因表达聚类的一致性。最高共相关系数（Coph. Coef；k = 3）显示最稳定的肿瘤分组，涉及 250 个基因和 10,000 个甲基化探针。（C）177 例原发性 ATRT 的临床、分子和基因型特征。通过甲基化或基因表达确定的肿瘤亚群以红色（1 组）、蓝色（2A 组）、绿色（2B 组）或灰色（无可用组）条表示；临床（肿瘤位置、患者年龄、转移状态）、CNAs 的全局模式（染色体或亚染色体 / 焦点）以及个别肿瘤中 SMARCB1 改变的类型一并标出。与亚群显著相关的临床或分子特征以红色标出。SMARCB1 改变被分类为局灶性（点突变、小片段插入 / 缺失、基因间缺失）或广泛性（基因内事件、大片段缺失）。（D）ATRT 亚群的肿瘤位置、中位年龄和年龄分布。箱线图中间为中位数，箱体边界代表第一和第三四分位数，须代表第 10 和第 90 百分位数。图 3：ATRT 亚群具有 distinct 的谱系富集转录和甲基化特征。（A）显示 ATRT 亚群特异性基因的星burst图，这些基因在甲基化（x 轴）和基因表达（y 轴）方面存在相互变化。与 1 组（左图；红色）、2A 组（中图；蓝色）和 2B 组（右图；绿色）ATRT 相关的基因被突出显示。（B）通过 ingenuity pathway analysis（IPA）分析每个亚群中表达差异 ±2 倍的亚群特异性基因，确定每个亚群的前十大（上轴）富集通路；通路的相对富集程度在下轴显示。（C）通过监督 t 检验并采用 FDR 校正，确定 ATRT 中亚群富集的神经 / 间充质谱系及 NOTCH/BMP/HOX 信号基因的基因表达热图。实线和虚线框分别显示在单个亚群中富集的基因或在 2A 和 2B 亚群中共享的基因。（D）热图显示 ATRT 亚群中代表性谱系基因的甲基化水平；显示 ASCL1、OTX2 和 HOXB2 中探针的甲基化状态相对于转录起始位点的情况。图 4：ATRT 亚群具有独特的染色质景观和功能基因组。（A）对 5 例原发性 ATRT 的 ATAC-seq 数据进行主成分分析（PCA）和相关性分析。使用 HOMER 软件将 ATAC-seq 测序读段转换为峰值标签计数，并使用 DiffBind 软件进行 PCA 和相关性分析；颜色梯度表示样本的相关性。热图显示在 1 组和 2 组 ATRT 中富集的峰值。（B）1 组（T4、T13）、2A 组（T26、T27）和 2B 组（T45）ATRT 的全基因组染色质开放性轮廓。通过 DiffBind 分析 ATAC-seq 数据，鉴定出差异开放的染色质峰值（FDR < 0.5）。热图显示在峰值中心 ±2.5 kb 范围内 20 bp 一个 bin 的平均读段密度，以及通过 RNA-seq 测定的个体肿瘤中相应基因的 FPKM 值。颜色比例尺与读段富集程度成正比，并相对于输入 DNA 在 ChIP-seq 实验之间进行标准化。（C 和 D）在原发性肿瘤和细胞系中，亚群特异性谱系（C）和信号传导（D）基因的 ATAC-seq 比对轨迹。基因轨迹相对于 hg19 RefSeq 注释和 ATRT 分子亚群（红色，1 组；蓝色，2A 组；绿色，2B 组）显示。图 5：Notch 和 BMP 抑制剂对 ATRT 细胞生长具有亚群特异性影响。（A）显示十个 ATRT 细胞系的分子亚型，基于原发性 ATRT 基因表达数据的 PAM 预测基因分类器的热图，以及细胞系和原发性肿瘤中 Notch 细胞内结构域（NICD）和 pSMAD1/5 表达的西方印迹分析。UW228 <a href='/bingzhong/smxbl/' target='_blank'><u>髓母细胞瘤</u></a>细胞系作为 SMARCB1 表达的对照（C）；微管蛋白作为装载对照。（B）分别在用 DAPT 和 dorsomorphin（DM）处理后的第 3 天和第 5 天，对 1 组和 2 组细胞系进行 MTS 测定，细胞活性相对于 DMSO 处理的对照组进行了标准化。（C 和 D）通过 qRT-PCR 分析相应的靶基因以及西方印迹分析 NICD 和 pSMAD1/5，证实了 DAPT 和 DM 对 ATRT 细胞中 Notch 和 BMP 信号的影响。对 1 组（C）和 2 组（D）细胞系使用增加剂量（黑色三角形）的 DAPT 或 DM 进行处理，并交叉使用单剂量的 DM 或 DAPT 进行处理；±符号表示特定药物的存在或缺失。mRNA 水平相对于肌动蛋白以及载体处理的对照组（黑色条）进行了标准化。使用 Student’s t 检验计算显著性。（E）使用 Alamar 蓝色测定法评估用 RBPJ（25 nM）和错配对照（20 nM）siRNA 处理的 1 组（CHLA04, 05）和 2 组（BT12, 16）细胞系的细胞活性；西方印迹和 qRT-PCR 分析证实了 RBPJ 的敲低。误差条显示 ±SEM（n = 3）。图 6：信号和表观遗传通路抑制剂对 ATRT 细胞生长的亚群特异性影响。（A）用指定小分子处理 7 天的细胞系的细胞活性通过 MTS 测定法相对于 DMSO 对照确定，误差条显示 ±SEM（n = 3）。（B）用指定化学物质处理的细胞系的 MTS 测定法总结。+ 和 − 分别表示细胞活性减少 > 或 <30%。（C）用 0.3 nM–10 μM 达沙替尼处理 1 组和 2 组细胞系；用 Alamar 蓝色测定法在处理后第 6 天确定 IC50。（D）对携带 BT12 细胞系异种移植物的小鼠进行 Kaplan-Meier 生存分析，这些小鼠接受 30 mg/kg 腹腔注射达沙替尼治疗 2 周。点图（中间条代表平均值，须代表第 10 和第 90 百分位数）和生物发光成像（BLI）图像显示了三只代表性对照和处理小鼠在注射后第 21 天的肿瘤质量。使用 log-rank（Mantel-Cox）检验和 ANOVA 分析分别评估生存和肿瘤生长的差异。（E）ATRTs 中达沙替尼 / 尼洛替尼的 PDGFRB（红色）及假定受体（绿色）和细胞质酪氨酸激酶（棕色）靶标的基因表达热图。通过 FDR 校正的 Student’s t 检验确定显著性。（F）原发性 ATRT 中总 PDGFRB 和 pPDGFRB 的西方印迹分析。图 7：PDGFRB 增强子元件在 2 组 ATRT 中表现出差异甲基化和染色质结合。（A）CSF1R（绿色）和 PDGFRB（紫色）相对于 UCSC 和 / 或 ENCODE 轨迹以及 flanking 基因（chr5:149,370,252-149,566,612）的示意图，放大视图显示了相对于 CSF1R（蓝色）和 PDGFRB 启动子（紫色）外显子 1 和基因体的假定增强子（chr5:149,479,360-149,545,365），450k 探针位置，DNaseI 超敏反应，以及 ENCODE 细胞系的 H3K27Ac、H3K4Me1 和 H3K4Me3 ChIP-seq 数据轨迹。在 2 组 ATRT 中相对低甲基化的 PDGFRB 启动子和假定增强子中的探针以红色字体显示，并用虚线的粉色和橙色框标出。（B）显示原发性 ATRT 和细胞系数据中 CSF1R/PDGFRB 的 ATAC-seq 信号，并显示 C3D 预测的 PDGFRB 增强子和启动子的关联（曲线）。下轨迹显示了对达沙替尼敏感的 2 组细胞系 BT12 的 H3K27Ac ChIP-seq 信号。1 组、2A 组和 2B 组原发性 ATRT 和细胞系分别以红色、蓝色和绿色标出。（C）通过 C3D 分析预测肿瘤 T26（上面板）和 T27（下面板）ATAC-seq 数据的 PDGFRB 启动子周围 120 kb 窗口内相关开放染色质区域的相关矩阵。绝对相关性与彩色方块的大小成正比，正负相关分别以蓝色和红色标出。所有相关性均在 PDGFRB 启动子周围 500 kb 窗口中进行测试，并通过 FDR 方法校正统计显著性；空白方块表示相关性不显著。（D）PDGFRB 和 CSF1R 基因表达（log2，y 轴）与增强子域、PDGFRB 基因体、北（N）岸、CpG 岛和 PDGFRB 启动子处的甲基化水平（β 值，x 轴）的皮尔逊相关性 / 线性回归分析。基于 75 例 ATRT 的 450k 数组数据的 CSF1R-PDGFRB 探针的差异甲基化位置示意图。图 8：启动子 - 增强子环路调节 PDGFRB 表达并赋予 2 组 ATRT 对达沙替尼 / 尼洛替尼的敏感性。（A）ATRT 细胞系 CHLA05（红色）和 BT12（蓝色）中 PDGFRB 增强子：启动子相互作用的 3C 分析。图表示假定增强子中的锚定引物与 CSF1R/PDGFRB 基因体和启动子中不同距离的测试引物的相对共扩增和相互作用频率（灰色条）。（B）3C 分析示意图，显示 PDGFRB 启动子与上游 50 kb 处的增强子之间的 DNA 环路和直接相互作用。（C）ATRT 细胞系中 pPDGFRB 表达的西方印迹分析。（D）用 50 nM 达沙替尼（+）和 DMSO（−）处理后 2 组细胞系的总 PDGFRB 和 pPDGFRB 表达的西方印迹及相应的光密度分析。误差条显示 ±SEM（n = 3）。 06PART关于作者国际儿童脑肿瘤大咖 James T. Rutka教授教授是世界神经外科联合会(WFNS)执行委员会&顾问委员会成员之一，发表超过500多篇的文章，在临床上的研究方向以颅内肿瘤为主，对<a href='/bingzhong/jiaozhiliu/' target='_blank'><u>胶质瘤</u></a>、纤维瘤、颅咽管瘤、室管膜瘤具有多年的临床经验，擅长清醒开颅术、显微手术和被广泛用于治疗恶性脑瘤和癫痫的国际前沿技术激光间质热疗（<a href='/qianyan/litt/' target='_blank'><u>LITT</u></a>）技术经验，对于儿童胶质瘤，尤其是高级别胶质瘤开展多项临床试验，其所在的医院加拿大SickKids是国际知名的儿童医院之一。

　　05. 肿瘤和患者信息

　　所有肿瘤和临床信息均通过国际协作网络收集，并按照参与机构医院研究伦理委员会批准的协议获得知情同意。共收集了194例中枢神经系统(CNS)样本(191例原发性和3例复发性)和9例非中枢神经系统(non-CNS)横纹肌瘤(RT)样本用于基因组分析(表S3)。所有非典型畸胎瘤样横纹肌瘤(ATRT)均根据世界卫生组织(WHO)中枢神经系统肿瘤分类标准(Louis和Wiestler，2007)诊断，并通过BAF47免疫染色(BD Biosciences，目录号612110)确认。通过荧光原位杂交(FISH)、多重连接探针扩增(MLPA)、针对外显子1-9的Sanger测序或全基因组/外显子组测序(WGS/WES)分析，确认了SMARCB1基因的双等位基因改变。对冰冻肿瘤样本的DNA或RNA进行了全基因组/外显子组测序(WGS/WES)、RNA测序(RNA-seq)以及高分辨率拷贝数/SNP、基因表达和甲基化阵列分析中的一种或多种;对123例来源于甲醛固定、石蜡包埋材料的DNA样本进行了Illumina 450k甲基化阵列分析。动物实验按照多伦多表型基因组学中心批准的动物伦理待遇政策和规定进行。

图 1：ATRT 编码基因组主要受结构改变影响。

　　图 1：ATRT 编码基因组主要受结构改变影响。 (A)ATRT 中全基因组和编码区体细胞突变率。使用 26 例原发性 ATRT 的 WGS 和 WES 数据(匹配正常 DNA)计算每兆碱基体细胞突变率中位数。箱线图中间为中位数，箱体边界代表第一和第三四分位数;须代表最小值和最大值。 (B)180 例原发性 ATRT 的复发性结构改变的 Circos 图，包括通过整合 WGS、RNA 测序、SNP 和 450k 甲基化阵列拷贝数数据检测到的 SCNAs 和基因重排。 (C)相对于 SMARCB1 蛋白 DNA 结合域(DBD)和重复区域 1 和 2(Rp1 和 Rp2)的 SMARCB1 改变示意图。 (D)通过 RNA 测序在 ATRT T51 中发现的 SMARCB1 第 5 外显子(灰色)和 HORMAD2 第 11 外显子(橙色)的 chr22q 染色体内融合示意图，显示融合 mRNA 的共识序列，以及通过 RT-PCR 和 Sanger 测序验证融合 mRNA。 (E)通过 WES 在 ATRT T12 中发现的涉及 SMARCB1 第 5 内含子(灰色)和 GTPBP1 第 1 内含子(蓝色)的 chr22q 染色体内易位示意图，显示相应基因片段的 CREST 预测 mRNA 共识序列，以及通过 PCR 和 Sanger 测序验证断裂点。

图 2：ATRT 包含三个具有不同临床特征和基因型的表观遗传亚群。

　　图 2：ATRT 包含三个具有不同临床特征和基因型的表观遗传亚群。 (A 和 B)通过无监督的共识层次聚类(HCL)和非负矩阵分解(NMF)聚类分析，基于 450k 甲基化阵列(A)或 Illumina HT12 基因表达阵列数据(B)对 ATRT 进行分类。调整后的 Rand 指数表示甲基化和基因表达聚类的一致性。最高共相关系数(Coph. Coef;k = 3)显示最稳定的肿瘤分组，涉及 250 个基因和 10.000 个甲基化探针。(C)177 例原发性 ATRT 的临床、分子和基因型特征。通过甲基化或基因表达确定的肿瘤亚群以红色(1 组)、蓝色(2A 组)、绿色(2B 组)或灰色(无可用组)条表示;临床(肿瘤位置、患者年龄、转移状态)、CNAs 的全局模式(染色体或亚染色体 / 焦点)以及个别肿瘤中 SMARCB1 改变的类型一并标出。与亚群显著相关的临床或分子特征以红色标出。SMARCB1 改变被分类为局灶性(点突变、小片段插入 / 缺失、基因间缺失)或广泛性(基因内事件、大片段缺失)。(D)ATRT 亚群的肿瘤位置、中位年龄和年龄分布。箱线图中间为中位数，箱体边界代表第一和第三四分位数，须代表第 10 和第 90 百分位数。

图 3：ATRT 亚群具有 distinct 的谱系富集转录和甲基化特征。

　　图 3：ATRT 亚群具有 distinct 的谱系富集转录和甲基化特征。 (A)显示 ATRT 亚群特异性基因的星burst图，这些基因在甲基化(x 轴)和基因表达(y 轴)方面存在相互变化。与 1 组(左图;红色)、2A 组(中图;蓝色)和 2B 组(右图;绿色)ATRT 相关的基因被突出显示。 (B)通过 ingenuity pathway analysis(IPA)分析每个亚群中表达差异 ±2 倍的亚群特异性基因，确定每个亚群的前十大(上轴)富集通路;通路的相对富集程度在下轴显示。 (C)通过监督 t 检验并采用 FDR 校正，确定 ATRT 中亚群富集的神经 / 间充质谱系及 NOTCH/BMP/HOX 信号基因的基因表达热图。实线和虚线框分别显示在单个亚群中富集的基因或在 2A 和 2B 亚群中共享的基因。 (D)热图显示 ATRT 亚群中代表性谱系基因的甲基化水平;显示 ASCL1、OTX2 和 HOXB2 中探针的甲基化状态相对于转录起始位点的情况。

图 4：ATRT 亚群具有独特的染色质景观和功能基因组。

　　图 4：ATRT 亚群具有独特的染色质景观和功能基因组。 (A)对 5 例原发性 ATRT 的 ATAC-seq 数据进行主成分分析(PCA)和相关性分析。使用 HOMER 软件将 ATAC-seq 测序读段转换为峰值标签计数，并使用 DiffBind 软件进行 PCA 和相关性分析;颜色梯度表示样本的相关性。热图显示在 1 组和 2 组 ATRT 中富集的峰值。 (B)1 组(T4、T13)、2A 组(T26、T27)和 2B 组(T45)ATRT 的全基因组染色质开放性轮廓。通过 DiffBind 分析 ATAC-seq 数据，鉴定出差异开放的染色质峰值(FDR < 0.5)。热图显示在峰值中心 ±2.5 kb 范围内 20 bp 一个 bin 的平均读段密度，以及通过 RNA-seq 测定的个体肿瘤中相应基因的 FPKM 值。颜色比例尺与读段富集程度成正比，并相对于输入 DNA 在 ChIP-seq 实验之间进行标准化。 (C 和 D)在原发性肿瘤和细胞系中，亚群特异性谱系(C)和信号传导(D)基因的 ATAC-seq 比对轨迹。基因轨迹相对于 hg19 RefSeq 注释和 ATRT 分子亚群(红色，1 组;蓝色，2A 组;绿色，2B 组)显示。

图 5：Notch 和 BMP 抑制剂对 ATRT 细胞生长具有亚群特异性影响。

　　图 5：Notch 和 BMP 抑制剂对 ATRT 细胞生长具有亚群特异性影响。 (A)显示十个 ATRT 细胞系的分子亚型，基于原发性 ATRT 基因表达数据的 PAM 预测基因分类器的热图，以及细胞系和原发性肿瘤中 Notch 细胞内结构域(NICD)和 pSMAD1/5 表达的西方印迹分析。UW228 髓母细胞瘤细胞系作为 SMARCB1 表达的对照(C);微管蛋白作为装载对照。 (B)分别在用 DAPT 和 dorsomorphin(DM)处理后的第 3 天和第 5 天，对 1 组和 2 组细胞系进行 MTS 测定，细胞活性相对于 DMSO 处理的对照组进行了标准化。 (C 和 D)通过 qRT-PCR 分析相应的靶基因以及西方印迹分析 NICD 和 pSMAD1/5.证实了 DAPT 和 DM 对 ATRT 细胞中 Notch 和 BMP 信号的影响。对 1 组(C)和 2 组(D)细胞系使用增加剂量(黑色三角形)的 DAPT 或 DM 进行处理，并交叉使用单剂量的 DM 或 DAPT 进行处理;±符号表示特定药物的存在或缺失。mRNA 水平相对于肌动蛋白以及载体处理的对照组(黑色条)进行了标准化。使用 Student’s t 检验计算显著性。 (E)使用 Alamar 蓝色测定法评估用 RBPJ(25 nM)和错配对照(20 nM)siRNA 处理的 1 组(CHLA04. 05)和 2 组(BT12. 16)细胞系的细胞活性;西方印迹和 qRT-PCR 分析证实了 RBPJ 的敲低。误差条显示 ±SEM(n = 3)。

图 6：信号和表观遗传通路抑制剂对 ATRT 细胞生长的亚群特异性影响。

　　图 6：信号和表观遗传通路抑制剂对 ATRT 细胞生长的亚群特异性影响。 (A)用指定小分子处理 7 天的细胞系的细胞活性通过 MTS 测定法相对于 DMSO 对照确定，误差条显示 ±SEM(n = 3)。 (B)用指定化学物质处理的细胞系的 MTS 测定法总结。+ 和 − 分别表示细胞活性减少 > 或 <30%。 (C)用 0.3 nM–10 μM 达沙替尼处理 1 组和 2 组细胞系;用 Alamar 蓝色测定法在处理后第 6 天确定 IC50. (D)对携带 BT12 细胞系异种移植物的小鼠进行 Kaplan-Meier 生存分析，这些小鼠接受 30 mg/kg 腹腔注射达沙替尼治疗 2 周。点图(中间条代表平均值，须代表第 10 和第 90 百分位数)和生物发光成像(BLI)图像显示了三只代表性对照和处理小鼠在注射后第 21 天的肿瘤质量。使用 log-rank(Mantel-Cox)检验和 ANOVA 分析分别评估生存和肿瘤生长的差异。 (E)ATRTs 中达沙替尼 / 尼洛替尼的 PDGFRB(红色)及假定受体(绿色)和细胞质酪氨酸激酶(棕色)靶标的基因表达热图。通过 FDR 校正的 Student’s t 检验确定显著性。 (F)原发性 ATRT 中总 PDGFRB 和 pPDGFRB 的西方印迹分析。

图 7：PDGFRB 增强子元件在 2 组 ATRT 中表现出差异甲基化和染色质结合。

　　图 7：PDGFRB 增强子元件在 2 组 ATRT 中表现出差异甲基化和染色质结合。 (A)CSF1R(绿色)和 PDGFRB(紫色)相对于 UCSC 和 / 或 ENCODE 轨迹以及 flanking 基因(chr5:149.370.252-149.566.612)的示意图，放大视图显示了相对于 CSF1R(蓝色)和 PDGFRB 启动子(紫色)外显子 1 和基因体的假定增强子(chr5:149.479.360-149.545.365)，450k 探针位置，DNaseI 超敏反应，以及 ENCODE 细胞系的 H3K27Ac、H3K4Me1 和 H3K4Me3 ChIP-seq 数据轨迹。在 2 组 ATRT 中相对低甲基化的 PDGFRB 启动子和假定增强子中的探针以红色字体显示，并用虚线的粉色和橙色框标出。 (B)显示原发性 ATRT 和细胞系数据中 CSF1R/PDGFRB 的 ATAC-seq 信号，并显示 C3D 预测的 PDGFRB 增强子和启动子的关联(曲线)。下轨迹显示了对达沙替尼敏感的 2 组细胞系 BT12 的 H3K27Ac ChIP-seq 信号。1 组、2A 组和 2B 组原发性 ATRT 和细胞系分别以红色、蓝色和绿色标出。 (C)通过 C3D 分析预测肿瘤 T26(上面板)和 T27(下面板)ATAC-seq 数据的 PDGFRB 启动子周围 120 kb 窗口内相关开放染色质区域的相关矩阵。绝对相关性与彩色方块的大小成正比，正负相关分别以蓝色和红色标出。所有相关性均在 PDGFRB 启动子周围 500 kb 窗口中进行测试，并通过 FDR 方法校正统计显著性;空白方块表示相关性不显著。 (D)PDGFRB 和 CSF1R 基因表达(log2.y 轴)与增强子域、PDGFRB 基因体、北(N)岸、CpG 岛和 PDGFRB 启动子处的甲基化水平(β 值，x 轴)的皮尔逊相关性 / 线性回归分析。基于 75 例 ATRT 的 450k 数组数据的 CSF1R-PDGFRB 探针的差异甲基化位置示意图。

图 8：启动子 - 增强子环路调节 PDGFRB 表达并赋予 2 组 ATRT 对达沙替尼 / 尼洛替尼的敏感性。

　　图 8：启动子 - 增强子环路调节 PDGFRB 表达并赋予 2 组 ATRT 对达沙替尼 / 尼洛替尼的敏感性。 (A)ATRT 细胞系 CHLA05(红色)和 BT12(蓝色)中 PDGFRB 增强子：启动子相互作用的 3C 分析。图表示假定增强子中的锚定引物与 CSF1R/PDGFRB 基因体和启动子中不同距离的测试引物的相对共扩增和相互作用频率(灰色条)。 (B)3C 分析示意图，显示 PDGFRB 启动子与上游 50 kb 处的增强子之间的 DNA 环路和直接相互作用。 (C)ATRT 细胞系中 pPDGFRB 表达的西方印迹分析。 (D)用 50 nM 达沙替尼(+)和 DMSO(−)处理后 2 组细胞系的总 PDGFRB 和 pPDGFRB 表达的西方印迹及相应的光密度分析。误差条显示 ±SEM(n = 3)。

　　06. 关于作者

　　国际儿童脑肿瘤大咖 James T. Rutka教授

　　教授是世界神经外科联合会(WFNS)执行委员会&顾问委员会成员之一，发表超过500多篇的文章，在临床上的研究方向以颅内肿瘤为主，对胶质瘤、纤维瘤、颅咽管瘤、室管膜瘤具有多年的临床经验，擅长清醒开颅术、显微手术和被广泛用于治疗恶性脑瘤和癫痫的国际前沿技术激光间质热疗(LITT)技术经验，对于儿童胶质瘤，尤其是高级别胶质瘤开展多项临床试验，其所在的医院加拿大SickKids是国际知名的儿童医院之一。

文章标题：【INC国际大咖研究成果】整合（表观）基因组分析确定中枢神经系统横纹肌样瘤亚群特异性治疗靶点
更新时间：2025-06-12 16:44:34